動物模型的制備和應(yīng)用實驗必須在具備相應(yīng)資質(zhì)的實驗室開展。動物模型的制備、應(yīng)用過程中的監(jiān)督管理、處置措施、對環(huán)境和生態(tài)影響等應(yīng)符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

小鼠通過限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）對小鼠的基因型進(jìn)行鑒定；通過Western blot方法使用STAT1的一抗蛋白對小鼠脾臟提取的蛋白樣本檢測；凝膠阻滯實驗中使用STAT緊密結(jié)合的探針，對小鼠胚胎纖維母細(xì)胞檢測STAT的激活情況。STAT1敲除小鼠和對照小鼠分別感染MHV病毒后，再通過組織切片觀察肝臟病理改變情況；另外，感染5000fpu的水皰性口炎病毒（VSV），并觀察小鼠的存活情況。

RFLP、WB和凝膠阻滯實驗的實驗結(jié)果：

STAT1和野生小鼠感染MHV后，肝臟病理改變情況：

可見STAT1-/-小鼠的肝細(xì)胞出現(xiàn)了壞死，并伴隨大量巨細(xì)胞。

VSV感染后小鼠存活狀態(tài)

STAT1敲除的小鼠對VSV感染更為易感，存活率明顯下降。該小鼠胸腺有T/B細(xì)胞，基因不能被干擾素IFN-α和IFN-γ激活，更易受病毒感染。

1. 背景小鼠選擇

背景小鼠C57BL/6J為近交系小鼠，是經(jīng)過全基因組測序的小鼠，具有實驗結(jié)果精度高、可比性好、應(yīng)激反應(yīng)均一等特點，是基因工程小鼠常用品系。本項目動物采用北京華阜康生物科技股份有限公司基礎(chǔ)群SPF級C57BL/6J小鼠。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF隔離器環(huán)境，溫度22-24℃；相對濕度40-70%，co60照射小鼠繁殖料；高壓滅菌水，動物自由采食和飲水。

2. 基因設(shè)計信息

2.1 靶基因位點選擇

靶基因名稱：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1基因Stat1 signal transducer and activator of transcription 1 [ Mus musculus (house mouse) ]

Gene ID: 20846

Also known as: AA408197; 2010005J02Rik

Location: 1 C1.1; 1 26.81 cM

Exon count: 26

Chromosome 1 - NC_000067.6

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/20846

mRNA: MMU06924; Protein: AAA19454. 749aa.

2.2 設(shè)計及構(gòu)建質(zhì)粒

利用CRISPR/Cas9技術(shù)，針對目的基因的插入位點尋找靶序列，根據(jù)靶序列信息設(shè)計針對該位點的guide RNA，經(jīng)活性檢測后，將具有活性的guide-RNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄成RNA，通過顯微注射將guide-RNA，Cas9 mRNA和重組DNA注射到受精卵中，從后代中篩選獲得基因定點插入的陽性小鼠。

3. 顯微注射及胚胎移植

gRNA經(jīng)體外合成、轉(zhuǎn)錄后與Cas9 RNA一起注射入C57BL/6小鼠受精卵細(xì)胞，受精卵細(xì)胞移植供體ICR小鼠。

4. F0代基因型鑒定

設(shè)計引物，PCR、DNA測序檢測出生仔鼠基因序列，獲得目標(biāo)基因型STAT1基因敲除小鼠。

PCR擴(kuò)增條件

5. F1代基因型鑒定

F0代小鼠與C57BL/6J小鼠雜交，獲得F1代雜交小鼠，通過PCR及基因測序進(jìn)行基因型鑒定。

信號轉(zhuǎn)到子和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）是絡(luò)氨酸激酶（Janus kinase，JAK）-STAT信號傳遞途中的重要環(huán)節(jié)，通過這一途徑細(xì)胞信號可以從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)，使相關(guān)基因活化，實現(xiàn)對細(xì)胞生長、分化等技能的調(diào)控；包括7個成員。STAT1能夠促進(jìn)凋亡、移植細(xì)胞生長、分化，在抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)：

1.Targeted Disruption of the Mouse Stat1 Gene Results in Compromised Innate Immunity

to Viral Disease.

2. STAT1 inhibits liver fibrosis in mice by inhibiting stellate cell proliferation and stimulating NK cell cytotoxicity.

3. Accelerated Apoptosis of Lymphocytes by Augmented Induction of Bax in SSI-1 (STAT-Induced STAT Inhibitor-1) Deficient Mice.

4. STAT1 mediates the increased apoptosis and reduced chondrocyte proliferation in mice overexpressing FGF2.

5. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas

6. Filovirus Infection of STAT-1 Knockout Mice.

7. Generation of mice with a conditionalStat1null allele.